1. 反应

（1）取三个反应管，分别标记为阳性对照管（Positive）、测试管（Test）和阴性对照管（Negative），各加入25 μL的水化溶液（-20℃保存的水化液可以放37℃水浴融化），吹吸数次直到所有冻干粉剂彻底溶解（冻干品较难溶解，需要缓慢吹吸约20-50下。此过程，如有大气泡产生或者小气泡过多，必须去除，否则严重影响反应结果！气泡可以用套管离心的方法去除）。尽量在没有操作过支原体的房间进行上述步骤。将所有反应管盖子盖上，在另外一个房间内进行下一步的操作。

（2）往阳性对照管中加入1 μL阳性支原体DNA，测试管中加入1 μL待测细胞培养液，阴性对照管不加。

（3）水浴内反应：往每个反应管内加入25 μL矿物油，以防止水份挥发，盖上盖子，将反应管插入带孔的漂板内，放入已经升温到61℃的水浴内，准确反应60分钟。

注：a 试剂盒所用的酶对温度敏感，器显示温度与实际温度的温差尽量不超过0.5℃。如果温差超过2℃，将导致酶活性降低，扩增速度也降低，在规定的反应时内，阳性             对照可能无法呈现典型的蓝绿色。此时需用水银温度计校准水浴的温度。

   b 如方便使用PCR仪，强烈建议在PCR仪上进行反应，这样可以准确控制反应的时间和温度。PCR仪参数如下：61℃，60 min；20℃, ∞；热盖温度，100 ℃。

?  c 在带热盖的PCR仪上进行反应，无需在反应管内加入矿物油。

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